薄层色谱法的基本原理和方法

发布者:admin 发布时间:2019-10-27 06:05 浏览次数:

  薄层色谱法系将固定相均匀地涂铺在具有光洁表面的玻璃、塑料或金属板上形成薄层,在此薄层上用展开剂展开,使供试品所含的成分分离,将所得的色谱图与对照物按同法所得的色谱图比较,用于药品的鉴别或杂质检查的一种方法。按分离机制薄层色谱法可分为吸附、分配和胶束薄层色谱法。固定相为吸附剂的薄层色谱法称为吸附薄层色谱法;利用样品中的各组分在固定相与展开剂之间的分配系数的差别而实现分离的薄层色谱法称为分配薄层色谱法;以表面活性剂胶束溶液为展开剂的薄层色谱法称为胶束薄层色谱法。

  (1)自制薄层板:自制薄层板系指手工(或借助涂布器)将固定相涂布于玻璃板(或其他适宜的载板)上使成为有一定厚度的均匀薄层。除另有规定外,玻璃板要求光滑、平整,洗净后不附水珠,晾干。最常用的固定相有硅胶G、硅胶GF254、硅胶H和硅胶HF254,其次有硅藻土、硅藻土G、氧化铝、氧化铝G 微晶纤维素、微晶纤维素F254、烷基硅烷键合硅胶等。其颗粒大小一般要求粒径为5~40um。过去实验室常常自制薄层板,如今购置市售薄层板更为普遍。

  (2)市售薄层板:分普通薄层板和高效薄层板。常用的有硅胶薄层板、硅胶GF254薄层板、聚酰胺薄层板和氧化铝薄层板等。高效薄层板的粒径一般为5~10um。

  2.点样器有手动、半自动或自动点样等方式,手动点样时一般采用微量注射器或定量毛细管,应能使点样位置正确、集中。

  3.展开容器应使用适合薄层板大小的平底或双槽薄层色谱专用展开缸,并配有严密的盖子。水平展开时使用专用的水平展开缸。

  4.显色剂按各品种项下的规定。可采用喷雾显色、浸渍显色或置适宜试剂(如碘、浓氨水、浓盐酸等)的蒸气中熏蒸显色,检出斑点。

  5.显色装置喷雾显色可使用玻璃喷雾瓶或专用喷雾器,用压缩气体使显色剂呈均匀的细雾状喷出;浸渍显色可用专用玻璃器皿或适宜的玻璃缸代替;蒸气熏蒸显色可用双槽玻璃缸或适宜大小的干燥器代替。

  6. 检视装置为装有可见光、短波紫外光(254nm)、长波紫外光(365nm)光源及相应滤光片的暗箱,可附加摄像设备供拍摄色谱图用,暗箱内的光源应有足够的光照度。

  无载合剂薄层板系将固定相直接涂布于玻璃板上,除另有规定外,将1份固定相和3份水在研钵中沿同一方向研磨混合,去除表面的气泡后,置玻璃板上使涂布均匀或倒入涂布器中,在玻璃板上平稳地移动涂布器进行涂布(厚度为0.2~0.3mm),取下涂布好的薄层板,置水平台上,于室温下晾干后,在110℃活化30分钟,随即置于有干燥剂的干燥器中备用。

  含黏合剂薄层板除另有规定外,系将固定相中加入一定量的黏合剂,一般常用10%~15%锻石膏(CaSO4·2H2O在140℃加热4小时),混匀后加水适量,或用0.2%~0.5%羧甲基纤维素钠水溶液(取羧甲基纤维素钠适量,加入一定量的水后,放置使溶胀,加热煮沸至完全溶解,放置,取上清液,即得)适量,在研钵中沿同一方向研磨混合调成糊状,去除表面的气泡后,均匀涂布于玻璃板上,晾干,活化后备用。

  薄层板使用前应检查其均匀度(可通过透射光和反射光检视),表面应均匀、平整、光滑,无麻点、无气泡、无破损、无污染。

  (2)市售薄层板:临用前一般应在110℃活化30分钟。聚酸胺薄膜不需要活化。铝基片薄层板或聚酰胺薄膜均可根据需要剪裁,但须注意剪裁后的薄层板底边的涂层不得有破损。如在存放期间被空气中的杂质污染,使用前可用适宜溶剂在展开容器中上行展开预洗,110℃活化后,置于干燥器中备用。

  2.点样除另有规定外,在洁净干燥的环境下,用点样器点样于薄层板上,一般为圆点,位置应正确、集中。点样基线cm(高效薄层板一般为0.8~1.0cm),样点直径为2~4mm(高效薄层板为1~2mm),点间距离可视斑点扩散情况以不影响检出为宜,一般为1.0~2.0cm高效薄层板可不小于5mm)。点样时必须注意勿损坏薄层板表面。

  3.展开层析缸预先用展开剂饱和可避免边缘效应。如需预饱和,可在缸中加入足够量的展开剂,必要时在壁上贴两条与缸一样高的宽滤纸条,一端浸入展开剂中,密封顶盖,一般保持15~30分钟,使系统平衡或按各品种项下的规定操作。

  将点好供试品溶液的薄层板放入展开缸的展开剂中,浸入展开剂的深度为距薄层板底边0.5~1.0cm(切勿将样品点浸入展开剂中),密封顶盖,待展开至适宜的距离(如20cm长的薄层板,展距一般为10~15cm,高效薄层板展距一般为5cm左右),取出薄层板,晾干,按各品种项下的规定检视。

  展开剂可以向一个方向进行,即单向展开;也可以进行双向展开,即先向一个方向展开,取出,待展开剂完全挥发后,将薄层板转动90o,再用原展开剂或另一种展开剂进行展开;亦可多次展开。

  4.显色与检视荧光薄层板可用荧光淬灭法。对于普通薄层板,有色物质可在日光下直接检视;无色物质可用物理或化学方法检视,物理方法是检出斑点的荧光颜色及强度,化学方法一般用化学试剂显色后,立即覆盖同样大小的玻璃板,检视。

  按各品种项下的要求对检测方法进行系统适用性试验,检测灵敏度、比移值(Rf)和分离效能,应符合规定。

  1.检测灵敏度系指杂质检查时,供试品溶液中的被测物质能被检出的最低量。一般采用对照溶液稀释若干倍的溶液与供试品溶液和对照溶液在规定的色谱条件下,在同一块薄层板上点样、展开、检视,前者应显示清晰的斑点。

  2.比移值(Rf) 系指从基线至展开斑点中心的距离与从基线至展开剂前沿的距离的比值。按式17-1计算:

  鉴别时,可用供试品溶液主斑点与对照品溶液主斑点的比移值进行比较或用比移值来说明主斑点或杂质斑点的位置。

  3.分离效能鉴别时,将对照品与结构相似的药物对照品制成混合溶液,按规定方法展开后,应显示两个清晰分离的斑点。杂质检查时,考察分离效能:可将杂质对照品用供试品溶液的自身稀释对照溶液溶解制成混合对照溶液;也可将杂质对照品用待测组分的对照品溶液溶解制成混合对照溶液;或者采用供试品溶液以适当的降解方法获得的溶液。上述溶液点样展开后的色谱图中,应显示清晰分离的斑点。

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