TLC 薄层层析技术总结

发布者:admin 发布时间:2019-10-30 02:46 浏览次数:

  ,是在50年代从经典柱色谱法和纸色谱法基础上发展起来的一种色谱技术。60年代后,人们对薄层色谱法的标准化、规范化及扩大应用等方面进行了许多工作,使该方法日趋成熟。现已成为现代有机合成、高分子材料分离与解析的重要方法。结合柱分离的薄层色谱技术能够具有充分的实战意义。

  1)、玻璃板的要求:用于制备薄层板的玻璃板要求表面光洁、平整,最好使用厚薄1~2mm的优质平板玻璃,普通窗玻璃一般不宜用于制作薄层板,玻璃板需洗净至不挂水,晾干,贮存于干燥洁净处备用。玻璃板反复使用时,应注意经常用洗液及碱液清洗,保持玻璃板面的光洁是保证薄层板质量的最基本要求。

  :除另有规定外,将1份吸附剂加适量的水(如1份硅胶G一般加3份水),在研钵中用研杵沿一个方向小心研磨至成均匀的有适当粘稠度的胶浆,立即倾入涂布器中,均匀地向前推进涂布在玻璃板上;或按照不同涂布器的规定操作涂布;涂布好的薄层板于室温下在水平台上晾干,再在规定的温度(一般为105℃~110℃)下烘约30分钟活化,贮于干燥器中备用。薄层板的厚度一般为0.25~0.5mm.。

  样品点样位置。起点的最佳位置如图2和3所示。起点下缘的最小距离b取决于溶剂量。两个起点之间的距离c必须令平行移行的主成份不会相互触及。点状点样时原点的直径应小于或等于3mm(高效板原点的直径应更小),条带的长度d由点样样品体积或样品的种类和相对于板的尺寸点样的数目来决定。到板侧边的距离a必须足够大以避免分离区失线: 斑状样品点样的一般点样位置(a = 20mm, b = 10mm, c =两起点之间的距离。)

  方法B:不呈饱和状态;无滤纸;只有一个槽内有溶剂;每个展开室只有一块TLC/HPTLC板

  将点好样品的薄层板放入展开室的展开剂中,浸入展开剂的深度为距薄层板底边0.5—1.0cm(切勿将样点浸入展开剂中),密封室盖,等展开至规定距离(一般为10—15cm),取出薄层板,晾干,按各品种项下的规定检测,如需用薄层扫描仪对色谱斑点作扫描检出,或直接在薄层上对色谱斑点作扫描定量,则可用薄层扫描法。薄层扫描的方法,除另有规定外,可根据各种薄层扫描仪的结构特点及使用说明,结合具体情况,选择吸收法或荧光法,用双波长或单波长扫描。由于影响薄层扫描结果的因素很多,故应在保证供试品的斑点在一定浓度范围内呈线性的情况下,将供试品与对照品在同一块薄层上展开后扫描,进行比较并计算定量,以减少误差。各种供试品,只有得到分离度和重现性好的薄层色谱,才能获得满意的结果。

  若层析板分离的物质肉眼看不见又不能被紫外光活化,需加显色试剂浸渍或均匀喷洒于薄层板面上,直接观察或加热显色后观察。加热显色者须注意加热时间和温度,尤其含羧甲基纤维素钠的薄层板,加热温度过高或时间过长,容易引起板面的焦化,如用硫酸等显色剂更易造成板面的炭化而影响显色效果。有的成分加试剂后,如挥发油成分经香草醛硫酸显色,加热温度和时间长短不同或放置时间不同均可能使斑点的显色有所改变。有的品种可熏以试剂或试液的蒸气(如碘蒸气、氨蒸气)显色。

  铺板用的匀浆不宜过稠或过稀:过稠,板容易出现拖动或停顿造成的层纹;过稀,水蒸发后,板表面较粗糙。匀浆配比一般是硅胶G:水=1:2~3,硅胶G:羧甲基纤维素钠水溶液=1:2。研磨匀浆的时间,根据经验来定,与空气湿度有关,一般通过拿起研棒时匀浆下滴的情况来判断,越稠越难下滴。匀浆的稀稠除影响板的平滑外,也影响板涂层的厚度,进一步影响上样量。涂层薄,点样易过载;涂层厚,显色不那么明显。通常,板的质量对薄层鉴别的影响不是很大,影响最大的是展开剂的配制和展开系统的饱和。

  选择合适的量器把各组成溶剂移入分液漏斗,强烈振摇使混合液充分混匀,放置,如果分层,取用体积大的一层作为展开剂。绝对不应该把各组成溶液倒入展开缸,振摇展开缸来配制展开剂。混合不均匀和没有分液的展开剂,会造成层析的完全失败。各组成溶剂的比例准确度对不同的分析任务有不同的要求,尽量达到实验室仪器的最高精确度,比如:取1ml的溶剂,应使用1ml的单标移液管,移液管应符合计量认证要求,尽管多数时候这不是必须的。

  一般使用的是双槽的展开缸,一槽用来放展开剂,另一槽可加入氨水或硫酸。把待展开的板放入两槽间的平台,斜架着,盖上展开缸的盖子。让展开剂的蒸气充满展开缸,并使薄层板吸附蒸气达到饱和,防止边沿效应,饱和时间在半个小时左右。展开时难免要打开盖子把薄层板放入展开剂中,不过对薄层板与蒸气的吸附平衡影响不大,当然动作应该尽量轻、快。

  定量毛细管更适合较小体积的点样;微量注射器更适合较大体积的点样。这主要是因为微量注射器受小气泡、溶液回爬现象的影响较大。为避免不同定量毛细管理体制的占样误差,建议一块薄层板上最好用同一只定量毛细管。

  对样品溶解度过高会使样点发生空心现象,常用的溶剂为甲醇、乙醇、丙酮。经典TLC样点原点一般为直径3mm点间距离1-2cm底边距离1.5cm;HPLC样点原点一般为直径1mm点间距5mm底边距1cm。2、展开剂的选择

  TLC与HPLC相比,一个突出的优点就是流动相的选择具有更大的灵活性,流动相的选择的目的是使绝大部分样品的Rf值位于0.1-0.7之间并达到较好的分离,与此对应的是流动相要有适当的强度和组成。流动相强度越大,溶质Rf值越大,但很可能降低分离能力;另外单一溶剂很难分离较复杂的混合物、根据相似相溶原理,要使用多元溶剂体系。

  一般展开剂体系选择如下:根据分离样品性质、薄层色谱板性质选择一个二元溶剂体系,通过调节溶剂比例以寻求适合Rf值,适合的Rf值找到后,再寻求极性参数相同的二元溶剂体系两个,以这三个组成为三点组成一个三角形,则可看到:三角形顶点是二元体系,边是三元体系,三角形内是四元体系,并且极性一致,可根据几何原理得出任一点组成,这种方法较为直观,也较简单。

  1、定性鉴别化学上经典的定性鉴别,例如经典的有机定性分析或经典的毒物分析,是利用各种化合物的溶解度不同和所含功能基的不同,用溶剂提取或用试剂处理,把它们分组或分为单一组分,然后作试管反应或点滴反应(颜色反应),或根据它们衍生物的理化性质进行定性鉴别。这种方法的缺点是样品用量较大,分离手续麻烦,分析时间较长(几小时或几十个小时),并可能有杂质干扰,现采用合适的展开剂和显色剂在薄层上作为分离和鉴别,根据样品中组分的值和显色情况,同时用标准作对照,一般即能确证为某一化合物,用薄层色谱法定性,样品用量小,分离方便,分离时间短(几分钟或几十分钟),检出灵敏度高。例如,在毒物分析中检验是否巴比妥安眠药中毒时,取胃内容物或尿样品,先用盐酸酸化后,用提取,提取液脱水,过滤蒸干,溶于无水乙醇中,点在硅胶版上用氯仿无水乙醇(36:1)展开,用硫酸汞二苯偶碳酰肼试剂显色,并用标准品对照,依次见出巴比妥,,戊巴比妥和异巴比妥。鉴别速度快(1小时),这对于抢救中毒患者和及时为医生提供治疗方案极为重要。

  药品的纯度,通常用熔点,吸光值等物理常数作为鉴定的指标。但是薄层检查也是药品质量控制和杂质检查的一种有效方法,有时甚至比一般方法更有效。一些国家的药典和药品规范已经采用。方法是把一定量的样品溶液(例如,相当于样品10%)点在薄层上,用展开剂展开并显色,同时用纯品作对照,如果样品不只显示出纯品位置一致的一个斑点,则表示含有杂质。进一步可用薄层作杂质的限量检查。在上例中,如果已经知道显色剂对杂质的最小检出量为0.1%,在薄层上点样后不显出杂质斑点,则杂质的量低于0.1%,或低于限度,也就是样品的纯度不低于99.9%。例如镏体药物的合成和精致工作中,常含结构类似的杂质,即按上述方法控制其质量和杂质的限量。

  反应副产物的检出以及中间体的分析,在化学反应进行到一定时间或反应终了时,把反应液取出作薄层分析,可以知道还剩下多少原料药未起作用。方法是把反应液或其有机溶剂提取液点在薄层上,同时点原料作参比对照,看薄层上是否出现原料药斑点。还可以用薄层检查反应副产物。如果化学反应分步进行,则每一步反应的中间体的质量和产率也都可用薄层进行定性和定量。例如在合成强力霉素的过程中,需要中间体甲烯土霉素氢化物为脱氧土霉素。氢化反应是否完全,可用薄层检查,如果反应完全,则反应釜中几乎没有或只有极少量的甲烯土霉素存在,薄层板上只显示出一个脱氧土霉素,如果薄层板上有上下二个明显的斑点,表示反应还没有完全,尚需继续还原,直到只显示出脱氧土霉素的一个斑点为止才能出料。


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